D1-dehydrogenaza 3-ketosteroidowa 

Steroidy są powszechnymi zanieczyszczeniami środowiskowymi wód i gleb. W związku z tym są wykorzystywane jako źródło węgla i energii przez wiele mikroorganizmów. Degradację steroidów zaobserowano wśród wielu szczepów z rodziny Actinobacteria Proteobacteria, w szczególności w u przedstawicieli rodzaju Rhodococcus. Również bakterie patogenne takich jak Mycobacterium tuberculosis  wytworzyły zdolność do przeprowadzania degradacji steroidów co ułatwia im zasiedlanie organizmów eukariotycznych. Dla wszystkich tych bakterii jednym z kluczowych enzymów katabolicznych jest enzym zależny od dinukleotydu flawino-adeninowego (FAD) Δ1-dehydrogenaza 3-ketosteroidowa (KstD), która katalizuje proces 1,2-odwodornienia androst-4-en-3,17-dionu (AD) do androst-1,4-dien-3,17-dionu (ADD). 

schematic representation of 1,2-dehydrogenation catalyzed by KstD. Here double bond is introduced into androsteridione between C1 and C2, the enzyme gets reduced and FAD is reoxidized by DCPIP

Fig. 1. Katalityczne 1,2-odwodornienie katalizowane przez KstD (AcmB) ze S. denitrificans.

W naszym laboratorium prowadzimy badania biokatalitycznych właściwości szeregu enzymów z należących do klasy KstD z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1, Rhodococcus erythropolis oraz Pseudomonas putida.  Jesteśmy zainteresowani zarówno aspektami podstawowymi, takimi jak mechanizm reakcji, jak i aplikacyjnymi, tj. opracowaniem skutecznych metod wykorzystania enzymów KstD w procesie syntezy  1-dehydrosteroidów. Aby poznać mechanizm reakcji koncentrujemy się na badaniach kinetycznych  (testy w stanie stacjonarnym oraz z wykorzystaniem techniki zatrzymanego przepływu, pomairy kinetycznego efektu izotopowego), mutacjach  kluczowych aminokwasów w centrum aktywnym, badaniem struktury enzymu za pomocą technik spektroskopowych i krystalograficznych, jak również prowadząc modelowanie molekularne opisujące energetykę procesu katalitycznego (MD, QM:MM i QM:MD). 

Badania aplikacyjne koncentrują się głównie na inżynierii reakcji, immobilizacji enzymu i testach reaktorowych z wykorzystaniem całych komórek w połączeniu z badaniami przesiewowymi  nowych potencjalnych substratów, które nie są fizjologicznie odwadarniane przez enzymy z klasy KstD. 

Badania prowadzimy przy wsparciu finansowych Narodowego Centrum Nauki w ramach programu OPUS OPUS 2016/21/B/ST4/03798 "Mechanizm regioselektywnego utleniającego odwodornienia 3-ketosteroidów przez dehydrogenazę Δ1-cholest-4-en-3-onu ze Sterolibacterium denitrificans" i projektu Miniatura 2018/02/X/ST4/01963 "Poszukiwanie nowych ketosteroidowych dehydrogenaz bakteryjnych katalizujących utleniające odwodornienie steroidów"

Publikacje poświęcone temu tematowi:

  1. K. Sofinska, A. M. Wojtkiewicz, P. Wójcik, O. Zastawny, M. Guzik, A. Winiarska, P. Waligórski, M. Cieśla, J. Barbasz, M. Szaleniec, "Investigation of quaternary structure of aggregating 3-ketosteroid dehydrogenase from Sterolibacterium denitrificans: In the pursuit of consensus of various biophysical techniques", Biochim. Biophys. Acta-Gen. Subj., 1863 (2019) 1027-1039

  2. M. Tataruch, P. Wójcik, A. M. Wojtkiewicz, K. Zaczyk, K. Szymańska, M. Szaleniec, "Application of Immobilized Cholest-4-En-3-One Δ1-Dehydrogenase from Sterolibacterium Denitrificans for Dehydrogenation of Steroids", Catalyst, 10(12) (2020) 1460

  3. A. M. Wojtkiewicz, P. Wójcik, M. Procner, M. Flejszar, M. Oszajca, M. Hochołowski, M. Tataruch, B. Mrugała, T. Janeczko, M. Szaleniec, "The efficient Δ1-dehydrogenation of a wide spectrum of 3-ketosteroids in a broad pH range by 3-ketosteroid dehydrogenase from Sterolibacterium denitrificans", J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 202 (2020) 105731

  4. P. Wójcik, M. Glanowski, A. M. Wojtkiewicz, A. Rohman, M. Szaleniec, "Universal capability of 3‑ketosteroid Δ1‑dehydrogenases to catalyze Δ1‑dehydrogenation of C17‑substituted steroids", Microb. Cell Fact., 20 (2021) 119

  5. M. Glanowski, P. Wójcik, M. Procner, T. Borowski, D. Lupa, P. Mielczarek, M. Oszajca, K. Świderek, V. Moliner, A.J. Bojarski, M. Szaleniec, "Enzymatic Δ1‑Dehydrogenation of 3‑Ketosteroids - Reconciliation of Kinetic Isotope Effects with the Reaction Mechanism", ACS Catal., 11 (2021) 8211−8225

Patenty i złoszenia patentowe:

  1. P. Wójcik, A. M. Wojtkiewicz, M. Tataruch, J. Morzycki, M. Szaleniec, "Sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z diosgenonu", Polish Patent Application P.433249 (13.03.2020)

  2. A. Rugor, M. Szaleniec, T. Janeczko, M. Dymarska, E. Kostrzewa-Susłow, "Sposób wytwarzania propionianu androst-1,4-dien-3-on-17-olu", Polish Patent P.413209

  3. A. Rugor, M. Szaleniec, T. Janeczko, M. Dymarska, E. Kostrzewa-Susłow, "Sposób wytwarzania octanu androst-1,4,6-trien-3-on-17-olu", Polish Patent P.413207

  4. A. Rugor, M. Szaleniec, T. Janeczko, M. Dymarska, E. Kostrzewa-Susłow, "Sposób wytwarzania 17a-metyloandrost-1,4-dien-3-on-17-olu", Polish Patent P.413208